Rekayasa Genetika

•             Isolasi, kloning dan kharakterisasi gen Prokaryot (Bakteri)

•             Isolasi, Kloning dan kharakterisasi gen Eukaryot (yeast, jamur, algae, tumbuhan, serangga, hewan, manusia)

•             Metode-metode dan strateginya (PCR, Southern Blotting, Northern Blotting, Western Blotting, SDS-PAGE, Colony PCR, AFLP, RAPD, Mating, Kultur jaringan, kultur sel, media seleksi, DNA sequencing, Protein Sequensing,dll)

Isolasi, kloning dan kharakterisasi gene Prokaryot; Isolasi gene virulent Agrobacterium tumefaciens

•      Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri Gram negatif penyebab penyakit tumor Crown Gall pada tanaman

•      Beberapa strains bakteri ini juga ditemukan patogenik pada manusia

•      Ditemukan pada tahun 1917 oleh Smith

•      Awalnya diteliti sebagai model untuk mempelajari tumor/kanker pada manusia/hewan

Tumor Crown Gall

Sel Agrobacterium tumefaciens

Kultur Agrobacterium tumefaciens

•      LB (Louria-Bertani) Media

     Per 1000 ml :

            10 gram Pepton

             5 gram ekstrak yeast

             5 gram NaCl

•      Media Seleksi :  AB media (hanya Agrobacterium yang bisa tumbuh, kadang perlu ditambah Rifamfisin 10 ppm untuk lebih selektif.

•      Warna koloni; pink

AB Media (per 1 liter)

•      3 g K2HPO4

•      1 g NaH2PO4

•      1 g NH4Cl

•      0,3 g MgSO4.7H2O

•      0,15 g KCl

•      0,01 g CaCl2

•      2,5 mg FeSO4.7H2O

•      5 g Glukose

Gen-gen Virulen

•      Virulensi Agrobacterium ditentukan oleh sejumlah gen baik yang berada pada Ti plasmid maupun yang berada pada khromosom

•      Sangat jarang virulensi ditentukan oleh satu gen (single gen)

•      Bahkan sudah diketahui umum guna memunculkan kharakter terntetukan dibutuhkan sejumlah gen

Genetika Agrobacterium

Mekanisme Induksi Penyakit Tumor Crown Gall

Molecular Mechanism

Mutasi Transposon

•      Ada banyak jenis transposon (Tn3, Tn5, Tn10, dll. Ada juga retro-transposon)

•      Transposon adalah mobile extra chromosomal linear DNA (DNA linier non-khromosom yang mobil/bergerak)

•      Transposon pertama kali ditemukan oleh Mc.Clintox pada sel tanaman jagung

•      Karena sifatnya yang mobil transposon dapat digunakan dalam rekayasa genetika sebagai mutasi penyelip (insertion mutation)

Transposon 5 (Tn5)

Proses Mutasi: Melalui Konjugasi
(Cell Mating)

Prosedur Mutasi Tn5 dengan Metode Sel Mating

•        Kultur Bakteri:

a. Kultur A. tumefaciens :

•        Kultur sel A. tumefaciens (A208) pada AB medium agar dengan rifampisin 10 ppm, inkubasi pada suhu 28 oC overninght

•        Ambil single koloni lalu kultur pada media LB cair, diinkubasi pada suhu

        28 oC dengan digoyang (shaker) selama satu malam (overnight)

b. Kultur sel E. coli (Tn5)

•   Ambil E.coli (Tn5) dari kultur stok (glycerol/stub)

•   Kultur E. coli (Tn5) pada media LB agar dengan kanamisin 100 ppm, inkubasi overnight pada suhu 37 oC

•   Ambil single koloni lalu kultur pada media LB cair dengan kanamisin 100 ppm, inkubasi overnight pada suhu 37 oC

B. Panen dan Mating sel bakteri:

•       Centrifuge kultur cair bakteri (A. tumefaciens-A208 dan E. coli (Tn5)) selama 3 menit dalam 3000 -5000 rpm – dalam 1,5 ml Eppendorf tube

•       Buang supernatant

•       Cuci sel-sel bakteri (pelet) dengan distilled water steril)- pelet disuspen dalam distilled water steril

•       Centrifuge selama 3 menit dalam 3000 -5000 rpm

•       Suspen pelet sel-sel bakteri masing-masing dalam 300 l LB medium

•       Campurkan masing-masing 100 l (A. tumefaciens-A208 dan E. coli (Tn5)) dalam 1,5 ml Eppendorf tube.

•       Teteskan (spot) 50- 100 l campuran bakteri tersbut pada LB medium agar, inkubasi pada suhu 30 oC overnight

•       Kultur dengan roof kultur campuran bakteri tsb pada media AB dengan kanamisin 100 ppm (gunakan roof agar muncul banyak single colonies

•       Single Colonies yg tumbuh pada media AB kanamisin 100 ppm adalah A. tumefaciens yang telah membawa Tn5 (mingkin pada khromosomnya atau pada Ti plasmid nya.

•       Kultur single koloni ini pada media LB kanamisin 100 ppm untuk uji virulensi dan pada AB kanamisin untuk kultur stok

•             Virulent Assay (Uji Virulensi)

Uji virulensi mutan-mutan A. tumefaciens (Tn5) ini dapat dilakukan pada beberapa jenis tanaman, seperti; wortel, lobak, cocor bebek (kalanchoe), tembakau, dll.

Seleksi Avirulent Mutant

•      Dari sekitar 5000 – 6000 koloni (mutan A.tumefaciens-Tn5) yang diuji virulensinya pada penelitian ini ditemukan;

     * 2 koloni yang avirulen,

     *  10 koloni yang melemah virulensinya,                                           dan

     * satu koloni menjadi sangat virulen

Kharakterisasi Mutan Avirulen B119 dan B90

•      Karena yg mau diisolasi adalah gen virulen (gen yang terlibat dalam virulensi/patogenisitas A. tumefaciens, maka yang dianalisis lebih lanjut adalah mutan avirulen

•      Dilakukan analisis terhadap mutan B119 dan B90  (angka menunjukkan nomor koloni)

Tahapan induksi tumor Crown Gall oleh A. tumefaciens

•      Pertumbuhan A. tumefaciens

•      Kemampuan menempel (attachment) pd sel inang (tumbuhan)

•      Ekspresi gen-gen virulen pada Ti Plasmid

•      Prosesing T-DNA

•      Transfer T-DNA

•      Integrasi T-DNA pada genom inang (tumbuhan)

Mengapa menjadi avirulen

 

•      Uji Pertumbuan sel pada media

 

•      Uji Attachment (kemampuan bakteri menempel pada sel inang (tanaman)

•      Uji ekspresi gen-gen virulen Ti plasmid

Uji Ekspresi Gen-Gen Virulen
Ti Plasmid

Letak terselipnya Tn5 pada B119 dan B90

Elektroforesis Gel Agarose

•      Cara buat Gel  :

     Untuk total DNA dari bakteri digunakan 0,8% agarose;  0,8 g agarose dalam 100 ml bufer TAE

     Panaskan dalam mikrowave selama 5 menit

     Setelah dipanaskan biarkan dalam suhu ruang sampai hangat (60 oC) lalu tetesi dengan Ethidium bromida 10 l (10 mg/ml)

     Lalu tuangkan ke dalam cetakan gel(dengan sisir pembuat lubang-lubang sampel, tunggu sampai padat.  Siap digunakan untuk elektroforesis

Bufer TAE

•      40mM Tris-acetat,

     pH 7,9

•      2mM sodium EDTA

Elektroforesis

 dilaksanakan pada ;

100 volt atau 50 volt

Strategi untuk mengisolasi flanking DNA dari B119

•      Tn5 tidak memiliki sisi (site) pemotongan enzim EcoRI

•      B119 adalah mutan A. tumefaciens yang pd khromosomnya terselip Tn5, jadi kalau khromosom B119 dipotong dengan EcoRI maka pemotongan akan terjadi pada khromosom B119, bukan pada Tn5, sehingga pasti didapatkan Tn5 utuh dan DNA dari kromosom B119

Pemetaan terselipnya Tn5 pada khromosom A. tumefaciens

Sekuen flanking DNA

 

Strategi untuk mendapatkan fragmen DNA asal (A208) tempat Tn5 terselip (B119)

•      Isolasi DNA khromosom dari strain induk, A208, lalu potong dengan EcoRI

•      Elektroforesis

•      Southern Blotting dengan Probe flanking DNA

Sekuen DNA asal (Wild type) dan penentuan ORF

ORF (Open Reading Frame)

     Dari urutan DNA itu dilihat apakah terdapat ORF didalamnya dengan ketentuan:

     ORF mulai dari sekuen ATG (initiation kodon)

     ORF selalu diakhiri oleh stop kodon (TGA, TAG, TAA

Profil Hidropati (Hydropaty Profile) dari ORF

Uji ekspresi Protein

Kloning Fragmen DNA
TN5 + Flanking DNA

Cloning Gene (DNA)

•      Fragment DNA  10 kb (Tn5 dan flanking DNA)

Vektor Plasmid

•      Charomid (15 kb) ; digunakan vektor plasmid berukuran besar ini karena fragmen DNA yang diklon berukuran besar (10 kb)

•      Fragmen DNA yang diklon merupakan fragmen yang dihasilkan dari pemotongan dengan enzim EcoRI, maka vektor plasmidnya juga dipotong dengan EcoRI (pada multi cloning site)

•      Vektor plasmid ini membawa gen penanda yaitu gen untuk ketahanan pada ampisilin

Skema kloning

Prosedur dan Tahapan Kerja Kloning

•      Isolasi Vektor plasmid (dari sel E.coli)

•      Isolasi dan purifikasi fragmen DNA (insert)

•      Enzim digestion (Pemotongan dengan ECoRI)

•      Ligasi

•      Transformasi ke sel E.coli (host- Compitent cells)

•      Kultur pada media seleksi (LB Ampisilin 100ppm + X-gal)

•      Seleksi dan kultur koloni putih

•      Isolasi plasmid untuk membuktikan klon fragmen telah terjadi atau dapat dilakukan dengan Koloni PCR (lebih cepat)

E.Coli sebagai Host (sel inang)

•             E.coli digunakan karena beberapa alasan:

•             Genomnya kecil (sekitar 6 juta pasang basa)

•             Mudah dikultur; pertumbuhan cepat

•             Mudah direkayasa (dihilangkan faktor-faktor yang tidak inginkan; plasmid,dll)

•             Telah sangat banyak diteliti, sehingga sudah terkharakterisasi dengan baik

•             Terdapat banyak strain dan kompatibel

Prosedur pemotongan DNA dengan Endonuklease dan prosedur Ligasi

Prosedur dan tahapan kerja isolasi plasmid dari sel E. Coli

Prosedur Pembuatan Compitent Cells E.coli

Prosedur Transformasi DNA ke dalam sel E.coli

Prosedur Koloni PCR

Complementation Analysis